IMMUNOMODULATOR, IMUNOSUPRESAN, IMUNOSTIMULAN

IMMUNOMODULATOR

1. PENDAHULUAN

Imunomodulator adalah senyawa tertentu yang dapat meningkatkan mekanisme pertahanan tubuh baik secara spesifik maupun non spesifik, dan terjadi induksi non spesifik baik mekanisme pertahanan seluler maupun humoral. Pertahanan non spesifik terhadap antigen ini disebut paramunitas, dan zat berhubungan dengan penginduksi disebut paraimunitas. Induktor semacam ini biasanya tidak atau sedikit sekali kerja antigennya, akan tetapi sebagian besar bekerja sebagai mitogen yaitu meningkatkan proliferasi sel yang berperan pada imunitas. Sel tujuan adalah makrofag, granulosit, limfosit T dan B, karena induktor paramunitas ini bekerja menstimulasi mekanisme pertahanan seluler. Mitogen ini dapat bekerja langsung maupun tak langsung (misalnya melalui sistem komplemen atau limfosit, melalui produksi interferon atau enzim lisosomal) untuk meningkatkan fagositosis mikro dan makro (Gambar 1). Mekanisme pertahanan spesifik maupun non spesifik umumnya saling berpengaruh. Dalam hal ini pengaruh pada beberapa sistem pertahanan mungkin terjadi, hingga mempersulit penggunaan imunomodulator, dalam praktek.


Gambar 1.mekanisme stimulant imun non spesifik


Karakteristika imunomodulator dan metode penguji

Aktivitas suatu senyawa yang dapat merangsang sistem imun tidak tergantung pada ukuran molekul tertentu. Efek ini dapat diberikan baik oleh senyawa dengan berat molekul yang kecil maupun oleh senyawa polimer. Karena itu usaha untuk mencari senyawa semacam ini hanya dapat dilakukan dengan metode uji imunbiologi saja. Metode pengujian yang dapat dilakukan adalah metode in vitro dan in vivo, yang akan mengukur pengaruh senyawa kimia terhadap fungsi dan kemampuan sistem mononuklear, demikian pula kemampuan terstimulasi dari limfosit B dan T.

Metode uji aktivitas imunomoduator yang dapat digunakan,yaitu:

1. Metode bersihan karbon ("Carbon-Clearance")

Pengukuran secara spektrofluorometrik laju eliminasi partikel karbon dari daerah hewan. Ini merupakan ukuran aktivitas fagositosis.

2. Uji granulosit

Percobaan in vitro dengan mengukur jumlah sel ragi atau bakteri yang difagositir oleh fraksi granulosit yang diperoleh dari serum manusia. Percobaan ini dilakukan di bawah mikroskop.

3. Bioluminisensi radikal

Jumlah radikal 02 yang dibebaskan akibat kontak mitogen dengan granulosit atau makrofag, merupakan ukuran besarnya stimulasi yang dicapai.

4. Uji transformasi limfosit T

Suatu populasi limfosit T diinkubasi dengan suatu mitogen. Timidin bertanda ( 3 H) akan masuk ke dalam asam nukleat limfosit 1. Dengan mengukur laju permbentukan dapat ditentukan besarnya stimulasi dibandingkan dengan fitohemaglutinin A (PHA) atau konkanavalin A (Con A).

Persyaratan imunomodulator

Menurut WHO, imunomodulator haruslah memenuhi persyaratan berikut:

1. Secara kimiawi murni atau dapat didefinisikan secara kimia.
2. Secara biologik dapat diuraikan dengan cepat.
3. Tidak bersifat kanserogenik atau ko-kanserogenik.
4. Baik secara akut maupun kronis tidak toksik dan tidak mempunyai efek samping farmakologik yang merugikan.
5. Tidak menyebabkan stimulasi yang terlalu kecil ataupun terlalu besar.

Dasar fungsional paramunitas (menurut A. Mayr)

1. Terjadinya peningkatan kerja mikrofag dan makrofag serta pembebasan mediator.
2. Menstimulasi limfosit (yang berperan pada imunitas tetapi belum spesifik terhadap antigen tertentu), terutama mempotensiasi proliferasi dan aktivitas limfosit.
3. Mengaktifkan sitotoksisitas spontan.
4. Induksi pembentukan interferon tubuh sendiri.
5. Mengaktifkan faktor pertahanan humoral non spesifik (misalnya sistem komplemen properdin-opsonin).
6. Pembebasan ataupun peningkatan reaktivitas limfokin dan mediator atau aktivator lain.
7. Memperkuat kerja regulasi prostaglandin.



IMUNOSUPRESAN

Imunosupresan adalah kelompok obat yang digunakan untuk menekan respon imun seperti pencegah penolakan transpalansi, mengatasi penyakit autoimun dan mencegah hemolisis rhesus dan neonatus. Sebagain dari kelompok ini bersifat sitotokis dan digunakan sebagai antikanker.

Respon imun

Pada mahkluk tingkat tinggi seperti hewan vertebrata dan manusia, terdapat dua sistem pertahanan (imunitas), yaitu imunitas nonsepesifik (innate immunity) dan imunitas spesifik ( adaptive imunity).

1. Imunitas nonspesifik

Merupakan mekanisme pertahanan terdepan yang meliputi komponen fisik berupa keutuhan kulit dan mukosa; komponen biokimiawi seperti asam lambung, lisozim, komploment ; dan komponen seluler nonspesifik seperti netrofil dan makrofag. Netrofil dan makrofag melakukan fagositosis terhadap benda asing dan memproduksi berbagai mediator untuk menarik sel-sel inflamasi lain di daerah infeksi. Selanjutnya benda asing akan dihancurkan dengan mekanisme inflamasi.

2. Imunitas spesifik

Memiliki karakterisasi khusus antara lain kemampuannya untuk bereaksi secara spesifik dengan antigen tertentu; kemampuan membedakan antigen asing dengan antigen sendiri (nonself terhadap self) ; dan kemampuan untuk bereaksi lebih cepat dan lebih efesien terhadap antigen yang sudah dikenal sebelumnya. Respon imun spesifik ini terdiri dari dua sistem imun , yaitu imunitas seluler dan imunitas humoral. Imunitas seluer melibatkan sel limposit T, sedangkan imunitas humoral melibatkan limposit B dan sel plasma yang berfungsi memproduksi antibodi.

Aktivitas respon imun spesifik

Aktivitas sistem imun spesifik memerlukan partisipasi kelompok sel yang disebut sebagai antigen presenting sel

Indikasi imunosupresan

Imunosupresan digunakan untuk tiga indikasi utama yaitu, transplanatasi organ, penyakit autoimun, dan pencegahan hemolisis Rhesus pada neonatus.

1. transplantasi organ
2. penyakit autoimun
3. pencegahan hemolisis Rhesus pada neonatus



Prinsip umum terapi imunosupresan

Prinsip umum penggunaan imunosupresan untukmencapai hasil terapi yang optimal adalah sebagai berikut:

1. Respon imun primer lebih mudah dikendalikan dan ditekan dibandingkan dengan respon imun sekunder. Tahap awal respon primer mencakup: pengolahan antigen oleh APC, sintesis limfokin, proliferasi dan diferensiasi sel-sel imun. Tahap ini merupakan yang paling sensitif terhadap obat imunosupresan. Sebaliknya, begitu terbentuk sel memori, maka efektifitas obat imunosupresan akan jauh berkurang.
2. Obat imunosupresan memberikan efek yang berbeda terhadap antigen yang berbeda. Dosis yang dibutuhkan untuk menekan respon imun terhadap suatu antigen berbeda dengan dosis untuk antigen lain.
3. Penghambatan respon imun lebih berhasil bila obat imunosupresan diberikan sebelum paparan terhadap antigen. Sayangnya, hampir semua penyakit autoimun baru bisa dikenal setelah autoimuitas berkembang, sehingga relatif sulit di atasi.



IMUNOSTIMULAN

Imunostimulan ditunjukan untuk perbaikan fungsi imun pada kondisi-kondisi imunosupresi. Kelompok obat ini dapat memperngaruhi respon imun seluler maupun humoral. Kelemahan obat ini adalah efeknya menyeluruh dan tidak bersifat spesifik untuk jenis sel atau antibodi tertentu. Selain itu efekumumnya lemah. Indikasi imunostimulan antara lain AIDS, infeksi kronik, dan keganasan terutama yang melibatkan sistem lifatik. (Widianto B Matildha. 1987)

1. TERAPI HERBAL IMUNOMODULATOR

Nigella sativa L

Gambar 2. Jinten hitam (Nigella sativa L)

Diambil dari www.bh-froe.com/ZC/images/nigella%20sativa.jpg

1. Klasifikasi

Divisi : Spermatophyta

Sub divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledonae

Bangsa : Ranunculales

Suku : Ranunculaceae

Marga : Nigella

Jenis : Nigella sativa

Nama umum/dagang: Jinten hitam

Nama umum : jinten ireng (Jawa), kalonji (India), Haba-ul-sauda (Arab), Black cumin (Ingris) (Anonim.2000 dan Gillani Anwar-ul Hassan dkk.2004)

2. Deskripsi tanaman

Habitus : semak, semusim, tinggi ± 30 cm

Batang : tegak, lurus, beralur, berwarna hijau kemerahan

Daun : tunggal, lonjong, ujung dan pangkal runcing, tepi bergerigi,

pertulangan menyirip, berwarna hijau

Bunga : majemuk, bentuk karang, benang sari banyak, tangkai sari dan

kepala sari kuning, mahkota bentuk corong, berwarna putih

kekuningan

Buah : polong, bulat panjang, berwarna coklat kehitaman

Biji : kecil, bulat, warna hitam

Akar : tunggal, warna coklat (Anonim.2000)

3. Jenis yang ada

Terdapat 14 spesies tersebut diantaranya adalah : Nigella arvensis, Nigella ciliaris, Nigella damascena, Nigella hispanica, Nigella integrifolia, Nigella nigellastrum, Nigella orientalis, dan Nigella sativa.

4. Kandungan kimia

Biji jinten hitam mengnadung volatil oil yang berwarna kuning (22,7%), asam amino seperti albumin, globulin, lysin, leucin, isoleusin, valin, glysin, alanin phenylalanin, arginin, asparginin, cystine, glutamic acid, aspartic acid, isoleusin, prolin, serin, treonin, tryptopan, dan tyrosin, gula redusi, musilago, alkaloid, asam organik, tannin, resin, glukosida toksik, metarbin gykosida saponin, melanthin menyerupai helleborin, melanthiginin, abu, air dan asam arabik. Dalam biji juga ditemukan lemak, serat, mineral seperti Fe, Na, Cu, Zn, P,Ca dan vitamin seperti asam ascorbic, thiamin, niacin, piridoksin, dan asam folat.

Biji jinten hitam mengandung ester asam lemak: seperti asam palmitat, asam oleik, asam linoleik, dan asam dehidro stearik, terpenoid, alkohol alpipatik, dan ά-β-hidroksiketon tidak jenuh, sterol bebas, steril ester, steril glukosida dan glukosida steryl terasetilasi. Alkaloid yang telah diisolasi yaitu nigelliene, alkaloid isoquinolin,, nigellimin, dan alakaloid indazol, nigellidine. Juga mengandung lipase, phytosterol dan β-sitosterol.

Kandungan aktif biji jinten mencakup volatil oil yang terdiri dari carvone, keton tidak jenuh, terpen atau d-limonen yang dikenal dengan carvene, ά-pinen dan p- cymene. Kandungan aktif secara farmakologi pada volatile oil adalah thymoquinone, ditymoquinone, thymohidroquinone, dan thymol. Kandungan thmoquinone tertinggi sebesar 57,78% dimana air diberikan selama 12 hari. (Gillani Anwar-ul Hassan dkk, 2004)

5. Rumus Struktur Utama



Gambar 3. Struktur Kimia Utama Jinten hitam (Nigella sativa L)

Diambil dari WHO Monograph volume 1 1999(G63)

6. Khasiat dan kegunaan

Biji jinten hitam umumnya digunakan pada pengobatan tradisional, seperti diuretik, antihipertensi , memperbaiki proses pencernaan, antidiare, stimulan nafsu makan, emmenogogue, analgesik, anthelmintik, antibakteri dan digunakan untuk penyakit kulit. Jinten hitam juga telah dilakukan studi untuk aktivitas biologi dan memperlihatkan untuk antidiabetes, anticancer dan imunomodulator, analgesik, antimikroba, anti-inflamasi, spasmolitik, bronchodilatot, hepatoprotektive, antihipetensi, pelindung ginjal, dan antioksidan. (Gillani Anwar-ul Hassan dkk, 2004)

Hasil penelitian Medenica dkk. menunjukkan bahwa Nigella sativa L. mempunyai aktivitas immunomodulatory kuat dan aktivitas seperti interferon dan mampu menghambat cancer dan progresi sel endothelial dan menurunnya produksi angiogenic, faktor pertumbuhan protein fibroblastic oleh sel tumor.

7. Uji imunomodulator

Prinsip kerja

Diuji efek herbal melanin (ekstrak N.sativa) terhadap produksi 3 jenis sitokin: Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α); Interleukin 6 (IL-6) dan Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) pada sel monosit manusia, periferal blood mononuclear cell (PBMC) dan sel THP-1. Sel mendapat perlakuan melalui berbagai macam variasi konsentrasi melanin. Diamati ekspresi TNF-2,IL-6,VEGF pada 3 jenis sel. Diamati sekresi protein pada supernatant kemudian dideteksi dengan RT-PCR dan ELISA

Preparasi dan karakterisasi herbal melanin dari n. Sativa

* Melanin diekstraksi dari kulit biji N. sativa melalui solubilisasi alkali dan agregasi asam. Dimurnikan dengan cara dicuci dengan air destilasi dan vacuum drying.
* Ekstrak dianalisis menggunakan ESR (Electron Spin Resonance),IR,UV-VIS, NMR, XRD, Fluroscence, uji kelarutan, komposisi asam amino dan analisis elemental.
* Ekstrak kering dilarutkan dalam larutan NaOH 0,1 M pada konsentrasi 1g/L. pH ekstrak ditetapkan pada 7,4 menggunakan HCl konsentrat dan disaring menggunakan filter ukuran 0,4µm. Larutan stok melanin untuk penggunaan eksperimental disiapkan dalam air destilasi pada konsentrasi 0,1-1 g/L.



Kondisi sel kultur

* Sel THP-1 monosit diperoleh dari American Type Culture Collection (ATCC, Rockville,MD,USA)
* Sel dipelihara dalam RPMI 1640 diberi nutrisi serum bovine fetal dan 1% penisilin-streptomicin dengan kelembaban 5% pada suhu 370C. 24 jam sebelum dipakai medium ditempatkan pada RPMI 1640 bebas serum untuk menghindari efek serum terhadap ekspresi gen.



Isolasi sel darah

* Darah dikumpulkan dari sukarelawan sehat (usia 22-45 tahun). Darah diambil secara aseptis, dikumpulkan dalam tabung steril yang mengandung EDTA.
* PBMC dipisahkan melalui Ficoll-paque density gradients.
* Monosit murni diperoleh melalui antiCD14-coated microbeads (kolom separasi)
* Dengan tes flowcytometer menggunakan ekspresi antigen CD-14 dan CD-45, menunjukkan 90% sel merupakan monosit.



Induksi dan analisis pada tingkat mRNA sitokin

* Monosit dan PBMC dicampur dengan larutan ekstrak herbal melanin pada konsentrasi 50 dan 100µg/mL. ekspresi mRNA TNF-alfa, IL-6 dan VEGF diuji 3 jam berikutnya. Sel THP-1 juga diperlakukan sama, hanya saja ekspresi mRNA TNF-alfa dilakukan 3 jam berikutnya dan IL-6 serta VEGF dilakukan setelah 24 jam
* Sebagai kontrol positif digunakan E.coli Lipopolisaccharide (LPS).
* Total RNA sel diekstraksi dari sel monosit, PBMC, dan THP-1 menggunakan reagen TRIzol.
* Amplifikasi cDNA sitokin menggunakan PCR. Produk yang dihasilkan dipisahkan pada gel agarose 2% menggunakan elektroforesis dan visualisasi dengan pengecatan Etidium bromida



Induksi dan analisis pada tingkat protein sitokin

* Tujuan dari percobaan ini adalah menentukan apakah perubahan pada tingkat mRNA sitokin dikarenakan perlakuan dengan ekstrak sehingga menyebabkan perubahan juga pada produksi sitokin
* Sel ditambahkan ekstrak HM (10,50,100µg/mL) atau LPS (10 mg/mL) selama 24 jam sebelum supernatan diambil. Protein sitokin yang terdapat dalam supernatan diuji menggunakan ELISA
* Media RPMI 1640 digunakan sebagai kontrol negatif
* Kontrol tambahan diperoleh dengan menginkubasi 100µg HM dalam media RPMI selama 24 jam pada suhu 370C
* Rata-rata absorbansi dari 2x pengulangandihitung mneggunakan kurva standar. Konsentrasi ditentukan melalui ekstrapolasi kurva standar

.Uji toksisitas selular

* Toksisitas HM pada sel THP-1 ditentukan dengan uji proliferasi sel 3-(4,5 dimetiltiazol-2)-2, 5-difeniltetrazolium bromida (MTT).
* Sel ditempatkan pada medium dan diinkubasi , kemudian ditambahkan HM dengan konsentrasi 10,50, 100 µg/mL
* 24 jam sebelum time point, diberi reagen MTT 10 mL
* Setelah 2 jam dibiarkan dalam tempat yang gelap, diukur absorbansi pada 570 nm dengan ELISA (El-Obeid, A.,2006)
*

8. Uji toksisitas

Tenekoon melaporkan bahwa penggunaan oral N. sativa pada tikus jantan (Sprague–Dawley) slm 14 hari, menyebabkan peningkatan kadar enzim hepatic dan perubahan histopathological. Penggunaan campuran minyak N. sativa seeds berpotensi menimbulkan toksisitas pada mencit dan tikus dengan determinasi nilai LD50, perubahan biokimia, hematologi dan histopathologi. Toksisitas kronik dapat terjadi pada penggunaan oral dose 2 ml/kg body selama 12 minggu pada tikus, yang ditandai dengan terjadinya perubahan kadar enzim hepatic, peningkatan kadar serum cholesterol, triglyceride dan glucose, sedangkan jumlah leukocytes dan platelets menurun drastis dibandingkan nilai control, serta terjadi peningkatan kadar hematocrit dan hemoglobin. Fischer melaporkan bahwa penggunaan N sativa pada 344 tikus selama 14 minggu tidak menginduksi perubahan patologi liver, ginjal, limpa atau organ lain



Aloe vera (L.)


Gambar 4. Lidah buaya (Aloe vera L)

Diambil dari www.henriettesherbal.com

1. Klasifikasi

Divisi : Plantae

Sub divisi : Angiospermae

Kelas : Monocots

Bangsa : Asparagales

Suku : Asphodelaceae/Liliaceae

Marga : Aloe

Jenis : Aloe vera

Nama umum/dagang: Lidah buaya

2. Deskripsi tanaman

Habitus : tumbuhan liar di tempat yang berhawa panas

Batang : berbatang pendek tidak kelihatan karena tertutup oleh daun-daun

yang rapat dan sebagian terbenam dalam tanah

Daun : berbentuk pita dengan helaian yang memanjang, berdaging tebal,

tidak bertulang, berwarna hijau keabu-abuan, bersifaat sukulen

(banyak mengandung air) dan banyak mengandung getah atau lendir

(gel). Bentuk menyerupai pedang dengan ujung meruncing,

permukaan dilapisi lilin, dengan duri lemas dipinggirnya. Panjang

mencapai 50 - 75 cm, berat 0,5 kg - 1 kg, daun melingkar rapat di

sekeliling batang bersaf-saf.

Bunga : berwarna kuning atau kemerahan berupa pipa yang mengumpul,

keluar dari ketiak daun, berukuran kecil, tersusun dalam rangkaian

berbentuk tandan, panjang mencapai 1 meter. Bunga biasanya

muncul bila ditanam di pegunungan

Akar : akar serabut yang pendek dan berada di permukaan tanah. Panjang

berkisar antara 50 - 100 cm.

3. Jenis yang ada

Aloe barbadensis Mill., Aloe chinensis Bak., A. elongata Murray, A. indica Royle, A.

officinalis Forsk., A. perfoliata L., A. rubescens DC, A. vera L. var. littoralis König ex Bak., A. vera L. var. chinensis Berger, A. vulgaris Lam

4. Kandungan kimia

Kandunga kimia dari Aloe terdiri dari mono- dan poli sakarida (glucomannan dan polisakarida yang terdiri dari arabinosa, galaktosa dan xylosa); tannins, sterols, organic acids, enzymes (terdiri dari cyclooxygenase), saponins, vitamins dan minerals, serta terdapat juga lemak (kolesterol, asam gamolenat dan asam arachidonat). Kandungan kimia terpenting adalah hydroxyanthrone derivatives, yang utama aloe-emodin-anthrone tipe 10-C-glucoside, barbaloin (aloin) (15–40%) (8, 13), hydroxyaloin (about 3%), Barbaloin (_aloin) campuran dari aloin A (10S) [1] dan B

(10R), aloinoside A dan B.

5. Rumus Struktur Utama



Gambar 5. Struktur Kimia Utama Lidah buaya (Aloe vera L)

Diambil dari WHO monographs on selected medicinal plants)

6. Khasiat dan kegunaan

Kandungan polisakarida dari A. vera menunjukkan aktivitas immunostimulant, yang berperan sebagi aktivasi adjuvant terhadap produksi antibody spesifik dan meningkatkan pelepasan interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-a (TNF-a), dan interferon-c (INF-c). Pelepasan/release sitokin menstimulasi peningkatan mencapai 300% dalam replikasi fibroblast pada kultur jaringan dan meningkatkan fogositosis macrophage. Proliferasi fibroblasts diketahui memberikan respon terhadap luka bakar, ulcers, dan gangguan saluran cerna. Beberapa penelitian menyebutkan bahwa perubahan sedikit dala struktur, berat molekul atau konformasi dari polisakarida mempunyai efek yang dramatic dalam hal potensiasi. Sebagai contoh perbedaan aktivitas antiviral pada xylo-mannans dari Nothogenia fastigiata.

7. Uji imunomodulator

Preparasi ekstrak

Daun Aloe vera dicuci dengan air sampai bersih kemudian dipotong-potong melintang. Bagian epidermis yang tebal dibuang sedangkan bagian gel padat diambil dan dihomogenkan. Campuran gel yang homogeny diliofiliasi dan diekstraksi dengan etanol (95%). Filtrat dikumpulkan dan dikeringkan pada rotary evaporator. Residu disimpan dalam tempat kering yang steril pada suhu 40C sebelum dipakai. Ekstrak disuspensikan kembali dalam air destilasi pada saat akan digunakan.

Hewan

Mencit Swiss albino dengan berat badan 25±2 gram. Mencit dipelihara pada lingkungan dengan temperatur 25±20 dengan siklus 12 jam gelap/terang, diberi makan dengan makanan pellet standar, dan air ad libitum.

Pengujian efek ekstrak terhadap sel darah putih (penghitungan)

Mencit dibagi menjadi 3 kelompok secara random, masing-masing kelompok 6 mencit. Mencit pada kelompok A (kelompok control) diberikan larutan garam (5 ml/kg,i.p). Mencit kelompok B dan C diberikan ekstrak AVG i.p dengan dosis 150 mg/kg dan 300 mg/kg selama 5 hari. Darah diambil pada vena ekor sebelum pemberian pertama dan setiap hari ketiga setelah dosis kelima sampai 1 bulan. Total sel darah putih ditentukan dengan menggunakan hemositometer.

Pengujian efek ekstrak terhadap produksi antibodi

Tiga kelompok mencit, masing-masing kelompok terdiri dari 6 mencit,diimunisasi dengan dengan 2,5 x 108 sel darah merah domba secara i.p. Hewan dari kelompok B1 dan C1 diberi ekstrak 150 mg/kg,i.p dan 300 mg/kg, i.p setiap hari selama 5 hari. Darah diambil dari vena kaudal sebelum dosis pertama dan setiap hari ke tiga setelah dosis kelima hingga 1 bulan. Titer antibody ditentukan dengan metode hemaglutinasi. Hewan pada kelompoka diberikan larutan garam (5ml/kg,i.p)

Pengujian efek ekstrak terhadap sel pembentuk plak

Tiga kelompok mencit masing-masing terdiri dari Sembilan mencit diimunisasi dengan 2,5 x 108 SRBC i.p. Mencit pada kelompok B2 dan C2 diberikan ekstrak 150 mg/kg,i.p dan 300 mg/kg,i.p setiap hari selama 5 hari. Kelenjar limpa diambil, kemudian diproses, kemudian jumlah sel pembentuk plak ditentukan menggunakan metode Jerne dan Nordin. Hewan pada kelompok control menerima larutan garam (5 ml/kg,i.p).

Pengujian terhadap aktivitas fagositik makrofag peritoneal

Makrofag peritoneal dengan sodium kaseinat diberikan pada tiga kelompok mencit yang telah diberi ekstrak AVG (150 mg/kg,i.p atau 300 mg/kg,i.p)setiap hari selama 5 hari berturut-turut, sementara hewan pada kelompok kontrol diberikan larutan garam. Makrofag kemudian dikultur pada hari kelima dan aktivitas fagosit diuji menggunakan metode Mehara dan Vaidya menggunakan opsonized SRBC.

8. Uji toksisitas

Gejala-gejala over dosis berupa diare dan kehilangan cairan dan elektrolit terutama terjadi pada anak-anak dan orang lanjut usia. A. vera dikontraindikasikan bagi pasien cramps, colic, haemorrhoids, nephritis, atau yang mengalami gangguan abdominal seperti nyeri, mual atau muntah, wanita hamil dan menyusui karena bersifat gastrointestinal stimulant anthraquinone suatu komponen yang aktif sebagai laxative.





Rhizoma Curcumae Longae



Gambar 4. Kunyit (Rhizoma Curcumae Longae)
Diambil dari From Wikipedia, the free encyclopedia


1. Klasifikasi

Divisi : Plantae

Bangsa : Zingiberales

Suku : Zingiberaceae

Marga : Curcuma

Jenis : Curcuma longa

Nama umum/dagang: Saffron (Inggris), Kurkuma (Belanda), Kunyit (Indonesia);

Kunir (Jawa), Koneng (Sunda), Konyet (Madura)

2. Deskripsi tanaman
1. Habitus : tanaman herbal tinggi mencapai 1.0 m; tegak, menfleshy, main rhizome nearly ovoid (about 3 cm in diameter and 4 cm long).
2. Batang : berbatang pendek tidak kelihatan karena tertutup oleh daun-daun yang rapat dan sebagian terbenam dalam tanah
3. Daun : berbentuk pita dengan helaian yang memanjang, berdaging tebal, tidak bertulang, berwarna hijau keabu-abuan, bersifaat sukulen (banyak mengandung air) dan banyak mengandung getah atau lendir (gel). Bentuk menyerupai pedang dengan ujung meruncing, permukaan dilapisi lilin, dengan duri lemas dipinggirnya. Panjang mencapai 50 - 75 cm, berat 0,5 kg - 1 kg, daun melingkar rapat di sekeliling batang bersaf-saf.
4. Bunga : berwarna kuning atau kemerahan berupa pipa yang mengumpul, keluar dari ketiak daun, berukuran kecil, tersusun dalam rangkaian berbentuk tandan, panjang mencapai 1 meter. Bunga biasanya muncul bila ditanam di pegunungan
5. Akar : serabut berwarna coklat muda (Anonim. 2001 dan Anonim. 1999)



3. Jenis yang ada

Curcuma domestica Valeton., C. rotunda L., C. xanthorrhiza Naves, Amomum curcuma ( Anonim. 2001)

4. Kandungan kimia

Kunyit mengandung senyawa yang berkhasiat obat, yang disebut kurkuminoid yang terdiri dari kurkumin, desmetoksikumin dan bisdesmetoksikurkumin dan zat- zat manfaat lainnya Kandungan Zat : Kurkumin : R1 = R2 = OCH3 10 % Demetoksikurkumin : R1 = OCH3, R2 = H 1 - 5 % Bisdemetoksikurkumin: R1 = R2 = H sisanya Minyak asiri / Volatil oil (Keton sesquiterpen, turmeron, tumeon 60%, Zingiberen 25%, felandren, sabinen, borneol dan sineil ) Lemak 1 -3 %, Karbohidrat 3 %, Protein 30%, Pati 8%, Vitamin C 45-55%, dan garam-garam Mineral (Zat besi, fosfor, dan kalsium).

5. Rumus Struktur Utama




(Anonim. 199)


6. Khasiat dan kegunaan

Curcumin menghambat mediated IL-12 (interleukin 12) Th 1 yang tergantung pada neuronal demyelination dalam model murine model terhadap berbagai sklerosis oleh targeting Janus kinase 2, tyrosine kinase 2, STAT3 and STAT4. Curcumin secara spesifik melepaskan cytostatic dan efek cytotoxic terhadap tumor. Curcumin meningkatkan efek terhadap fungsi utama dari sel T, sel natural killer (NK), macrophages dan pada splenocytes total in-vivo. Varalakshmi dkk. melaporkan bahwa terjadi peningkatan efek immunomodulatory dalam hewan coba ascites-bearing. Studi ini memperkuat bahwa curcumin cukup aman dan dapat digunakan sebagai immunomodulator untuk system immune.

7. Uji imunomodulator



Uji in vivo efek immunomodulator curcumin dilakukan pada hewan coba tikus betina berat 100-150 g dengan usia 5-6 minggu. Pemberian curcumin dilakukan dengan injeksi (40 mg/kg/hari, i.p) selama 30 hari setiap interval 24 jam. Kelompok hewan coba terdiri dari: curcumin, curcumin+cyclosporine (CsA), CsA dan kelompok kontrol PBS. Pada hewan coba tikus, curcumin diberikan (40 mg/kg/tikus/24 jam selama 30 hari), cyclosporin A (10 mg/kg, i.p) diinjeksi 48 jam sebelum dikorbankan. (Varalakshmi Ch,et al. 2008)

Uji apoptosis sel tumor dengan flow cytomety

Induksi apoptosis pada sel tumor dan sel normal ditentukan dengan flow cytometry dengan pewarna propidium iodide, menunjukan bahwa induksi apoptosis pada CHO (Chines Hamster Ovary), rat skin fibroblat (RSF), human corneal epithel sel (HCE), rat lympohocyte dan hepatocyte yang beri curcumin gagal untuk diinduksi apoptosis, sedangkan induksi apoptosis pada beberapa cell line mengalami perubahan seperti MDAMB (breash carcinoma), OVCAR-8 (ovarian carcinoma), HepG2 (hepatocellular carcinoma) dan HL-60 (leukemia cell line). Induksi apoptosis curcumin pada semua sel tumor memberikan efek pada kultur utama atau tidak merubah sel pada kondisi yang sama. (Varalakshmi Ch,et al. 2008)


Uji lymphoproliferasi

Lymphoproliferasi disiapkan dari limpa kelompok kontrol, curcumin+cyclosporine A (CsA) dan curcumin atau CsA yang diinjeksi pada hewan coba dengan Ficoll-Hypaque gradient. 2x105 sel/sumur diinkubasi dengan ConA atau PHA (0,5 – 2,5 mg/mL) selama 48 jam diikuti dengan penambahan [3H] tymidinie (1mCi/sumur) dan diinkubasi hingga 24 jam. Sel kemudian di panen dan disatukan dengan radioaktif diukur dalam suatu Packard liquid scintillation counter. Dari hasil uji lymphoproliferasi memperlihatkan tidak ada perbedaan yang signifikan [3H] tymidinie antara kelompok perlakuan curcumin dan kontrol yang diamati secara in vitro.

Untuk mengecek kemampuan efek in vivo curcumin terhadap kemampuan proliferasi sel T, curcumin diinjeksi pada hewan coba (i.p) selama 30 hari dan splenocyte dari kelompok kontrol dan perlakuan injeksi-curcumin dipanen. Mitogen seperti PHA dan ConA diketahui secara spesifik dapat menginduksi proliferasi sel T. Lymphocyte dari kelompok kontrol dan hewan coba yang diinjeksi-curcumin di panen pada hari ke-30, dan dilakukan dengan perbedaan konsentrasi PHA (0, 1, dan 1.2 mg/mL). Hasil menunjukan peningkatan kemampuan lympoproliferasi sel T yang diamati pada hewan perlakuan injeksi curcumin. Selanjutnya untuk menkonfirmasi efek proliferasi curcumin secara in vivo, jumlah splenocyte di stimulasi dengan mitogen lain ConA (0 dan 2.0 mg/mL) dari hewan coba yang menerima curcumin hingga hari ke-20 dan 30. Seperti pada pengamatan dengan PHA, terjadi juga peningkatan efek lympoproliferasi yang meningkat dengan ConA. Konfirmasi dilakukan juga menggunakan immunosupresan cyclosporine A (CsA). Injeksi CsA memberikan hasil penurunan induksi proliferasi ConA sel T pada kelompok injeksi curcumin, juga memberikan efek yang tidak berarti pada kelompok kontrol. Peningkatan Ag-spesifik proliferasi sel T diamati juga pada hewan coba tikus yang diberi injeksi curcumin yang diinjeksi dengan sel tumor AK-5 sebagai sumber tumor Ag. (Varalakshmi Ch,et al. 2008)


Penentuan Reactive Oxygen Species (ROS)

Macrophag plate (Mfs) 2x106 sel/sumur dalam 150 mL phenol-red bebas IMDM dan anion superoksida ditetapkan dalam 80mM sitokrom C dengan/tanpa SOD (300 U/mL). Reduksi superoxide-induced pada ferrisitokrom ditetapkan dengan spektrofotometri pada 550 nm.

Hasil penentuan jumlah ROS secara ektraselluler tidak memberikan efek pada kelompok hewan coba yang diinjeksi dengan curcumin dibandingkan dengan kelompok kontrol. Efek null pada curcumin ini telah dikonfirmasi dalam isolat macrophage dari dua lokasi anatomi yang berbeda yaitu ruang peritoneal dan limpa. Pada hari ke-10 dan 20 terjadi peningkatan jumlah ROS secara intraselluler pada macrophage peritoneal, dimana pada hari ke-30 tingkatnya sama dengan kelompok kontrol. Pada macrophage limpa tidak memperlihatkan perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol dan kelompok injeksi-cucumin. ROS intraselluler yang tinggi dalam magrophage peritoneal pada hari ke-20 dan 30, memperlihatkan pencerminkan efek lokal curcumin dalam ruang peritoneal sejak efek yang sama tidak diamati pada splenic macrophage.

Pengamatan tingkat ROS secara intraselluler dilakukan juga pada hewan coba tikus dalam magrophage peritonel dan limpa yang mendapatkan curcumin, curcumin+CsA atau CsA. Dengan adanya CsA, meningkatkan jumlah ROS yang dapat ditemukan dalam magrophage peritoneal dan limpa pada hari ke-20 tetapi tidak ditemukan pada hari ke-30. Bagaimanapun peningkatan oksidatif juga diamati dengan CsA pada hari ke-20, karena data menujukan efek yang sinergis pada curcumin yang dihubungkan dengan CsA pada hari ke-20.

Evalusi modulasi pada ROS generation dalam Magrophage melalui curcumin dan tumor, kami mentransplantasi sel tumor AK-5 (i.p) pada kelompok kontrol dan injeksi curcumin (30 hari diberikan curcumin). Pada hari ke-5 setelah tumor ditransplantasi, tidak ada efek tumor AK-5 yang diamati ada jumlah ROS dalam limpa magrophage yang dibandingkan dengan kelompok kontrol. Jadi tingkat ROS pada transplantasi AK-5 pada injeksi-curcumin, tidak memberi efek perubahan. (Varalakshmi Ch,et al. 2008)



Penentuan efek Nitric Oxide (NO)

Macrophag (Mfs) yang dikultur selama 16 jam, 100 mL sel bebas supernatan merupakan aspirat dan mengandung NO yang diukur menggunakan reagen Griess. Absorbansinya pada 540 nm yang diukur menggunakan ELISA reader. Dari hasil penentuan efek NO, tidak ada perbedaan signifikan yang terlihat antara kemampuan sekresi NO antara kelompok kontrol dengan injeksi-curcumin pada kedua macrophage pertitoneal dan limpa. (Varalakshmi Ch,et al. 2008)

Uji sitotoksik

Pengaruh curcumin terhadap kemampuan sitotoksik sel NK (Natural Killer Cell), isolat sel NK dari hewan coba kelompok kontrol dan injeksi-curcumin pada hari yang berbeda (10, 20, dan 30) dan memperlihatkan kemampuan terhadap sel tumor YAC-1 dalam 4 jam dengan 51Cr release assay. Sel NK limpa dari kelompok kontrol dan injeksi-curcumin membuktikan tingkat yang sama pada sitotoksik terhadap target YAC-1 pada 100:1. Injeksi CsA menghilangkan fungsi sitotoksik pada isolat sel NK dari kelompok kontrol dan injeksi-curcumin. (Varalakshmi Ch,et al. 2008)

Enzyme linked immunofiltration assay

Sitokin dalam sera pada kelompok hewan coba kelompok kontrol, curcumin, curcumin+Cyclosporine (CsA) atau CsA ditetapkan dengan mAbs spesifik menggunakan enzyme linked immunofiltration assay (ELIFA).

Hasil efek immunomodulator curcumin ditentukan dalam istilah tingkat sitokin dalam sampel serum kelompok kontrol dan injeksi-curcumin pada hari yang berbeda. Penentuan dilakukan terhadap IL-2, IL12 dan IFN-g dalam sampel serum. Semua, variasi kurang mempengaruhi tingkat IL-2 dan IFNg antara kelompok kontrol dan injeksi-curcumin. Tingkat yang lebih tinggi ditunjukan pada IL-12 pada kelompok injeksi-curcumin pada hari ke-10 dan 20 yang dibandingkan dengan kontrol pada hari ke-30. Kelompok kontrol dan injeksi-curcumin yang diberikan CsA, tidak menujukan hasil perubahan yang signifikan. Bagaimanapun, injeksi CsA pada kedua kelompok menyebabkan penurunan yang sama dalam tingkat sirkulasi IL-2 pada dosis curcumin yang digunakan tidak menginterferensi dengan produk normal IL-2. Profil konsentrasi IL-12 dan IFN-γ dalam kelompok kontrol yang diinjeksi CsA sama pada CsA dan injeksi-curcumin yang ditunjukan secara in-vivo tidak memberikan efek pada tingkat sitokin. (Varalakshmi Ch,et al. 2008)

8. Uji toksisitas

Tidak terlihat toksik pada pemberian secara per oral pada dosis tunggal ekstrak etanol turmerik 0,5; 1 atau 3 g/Kg BB mencit, atau serbuk turmerik 2,5 g/kg atau ekstrak etanol 300 mg/kg untuk tikus, kelinci dan monyet. Dosis tunggal curcumin 1-5 g/kg BB mengurangi efek toksik pada tikus.

Tidak ada kematian yang dapat diamati setelah pemberian curcumin pada mencit untuk dosis tunggal atau intraperitonial pada 2,0 g/kg BB.

Nilai LD50 akut intraperitonial pada mencit untuk fraksi petroleum eter, alkohol dan air dari turmerik dan pada curcumin ditetapkan pada 0,525; 3,980; 0,430; dan 1,5 g/kg BB secara berturut-turut. (Anonim. 2003)